Optimización de un protocolo de producción de ARNds para biopesticidas basados en ARNi

Los hongos y los oomicetos son los dos grupos más importantes de patógenos vegetales eucariotas. Los hongos patógenos como Fusarium circinatum o Fusarium graminearum, o los oomicetos patógenos Phytophthora cinnamomi y Phytophthora capsici están devastando bosques y cultivos en todo el mundo. Los métodos existentes para la gestión de las enfermedades causadas por hongos y oomicetos suelen ser limitados, caros y, con el tiempo, pueden hacer que el patógeno tolere el método de control. Además, la aplicación de fungicidas químicos puede tener un impacto negativo en los ecosistemas. De hecho, el uso de productos químicos en los bosques europeos está extremadamente limitado debido a la normativa legal vinculante y a las condiciones específicas relativas a la aplicación de productos fitosanitarios.
Por lo tanto, la búsqueda de productos respetuosos con el medio ambiente para la gestión de las enfermedades de las plantas es una prioridad en todo el mundo, y el ARN de interferencia ambiental (ARNi) ofrece una solución prometedora. La tecnología del ARNi, con su especificidad sin precedentes como objetivo de las plagas y su bajo impacto medioambiental, está evolucionando rápidamente como una prometedora alternativa segura a los pesticidas inorgánicos tóxicos. Pero el coste de producción del ARN representa un reto importante para el despliegue de la tecnología de pulverización de ARNds. Los métodos actuales de producción de ARNds incluyen la transcripción in vitro, la síntesis química y la fermentación microbiana.
En el marco del proyecto SUPERA (Proyectos de I+D+i en Líneas Estratégicas 2021), desarrollamos y probamos diferentes estrategias de fermentación microbiana diseñadas para la obtención de biomasa bacteriana y expresión de ARNds. Demostramos que la estrategia de fermentación optimizada basada en alimentación continua producía un aumento del rendimiento en términos de peso celular seco (DCW) de hasta 3 veces en comparación con una estrategia por lotes. Este estudio permite incrementar significativamente el rendimiento del ARNds generado durante el proceso de fermentación y favorecer el posterior proceso de escalado a nivel industrial.

1) Testar estrategias de fermentación alternativas diseñadas para la expresión y obtención de ARNds.
2) Incrementar significativamente el rendimiento del ARNds durante el proceso de fermentación.

Se planteó llevar a cabo diferentes pruebas de crecimiento empleando cepas de E. coli modificadas genéticamente productoras de ARNds, con el fin de evaluar el rendimiento del proceso de fermentación y la producción de ARNds. Para ello se utilizaron biorreactores a escala de laboratorio de 2 L y 5 L y se estudiaron diferentes parámetros de fermentación como los medios de cultivo (LB, DeLisa) y el modo de operación (batch, fed-batch, continuo).

Utilizando biorreactores a escala de laboratorio se estudiaron parámetros de fermentación como el medio de cultivo o el modo de operación, que influyen en la producción de ARNds. Se testaron dos medios de cultivo: LB (convencional) y DeLisa (económico). Los resultados muestran un incremento de DCW (g/L) utilizando el medio de cultivo DeLisa, en lugar del medio convencional LB. Además, la cantidad de ARNds extraído también fue mayor. Posteriormente, se probaron tres modos de operación: discontinuo, semicontinuo y continuo. Para la fermentación continua se utilizó un sistema de microfiltración tangencial, que recircula la biomasa y retira el caldo de cultivo del fermentador. Tras cada fermentación se realizó extracción del ARN. Los resultados mostraron que la estrategia en continuo mejoraba la DCW con respecto a los otros modos, incrementándose también la cantidad de ARNds. En conjunto, todo ello supone un mayor conocimiento si el proceso quiere ser escalado a nivel industrial.